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华体会平台官网电话:【评测】造血干细胞培养基

2022-07-03 10:59:37 |来源:hth华体会最新网站 作者:hth华体会网页版

  大家都知道,影响脐血CD+34细胞体外扩增的因素有很多,纵观近年来,关于基础研究结果发现了一系列有助于扩增HSC的培养体系及添加物,如细胞因子(SCF、TPO、FLT-3L、IL-3、IL-6、G-CSF等)、与基质细胞共培养,以及添加一些小分子物质(前列腺素E2)等 ,又或者进一步纯化脐带血干细胞以其获得体外扩增,但是这些方法获得的HSC仍不能满足临床需要。ZePingBio代理的LONZA推荐使用其明星产品X-VIVO系列无血清培养基作为替代培养基培养造血干细胞。其中X-VIVO 15 系列,支持包含造血干细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等多种细胞的增殖。

  免疫细胞在细胞和基因治疗中有着非常广泛的应用,无血清培养基是免疫细胞培养中一个非常关键的 环节。在整个过程中,免疫细胞培养基的安全性和一致性尤为重要,在短时间内获得高产量和高质量的效 应细胞,成为细胞和基因治疗的重要步骤。基于此,Lonza开发了 X-VIVO系列免疫细胞无血清培养基产品。

  •PBL、DC、CIK、NK、LAK, TIL、T细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、

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  为满足细胞治疗行业对于安全性和高标准生产的需要,LONZA公司的X-VIVO系列提供两种类型的培养基:所有的TheraPEAK™ X-VIVO™培养基均根据医疗器械法规(包括21 CFR Part 820 )进行生产,生产工 厂已通过FDA的IS。13485认证质量管理体系注册。用于进一步生产用途的GMP配方不含抗生素、不含酚红, 均标记FFM (For Further Manufacture)o用于科研使用的培养基含抗生素和酚红,仅标记RUO(Research Use 0nly)。

  IBS:我们报告了两个提高临床相关原代细胞类型中基于CRISPR-CAS9的基因组编辑效率的改进。添加在同源 定向修复(HDR)模板末端的Cas9靶序列(TCTS)与Cas9核糖核蛋白(RNP)相互作用,将模板递送到细胞核,使 HDR效率提高约2-4倍。此外,使用聚谷氨酸将Cas9RNPs稳定为纳米颗粒,进一步将编辑效率提高了近两倍, 降低了毒性,并使冻干储存不会失去活性。将这两项改进结合起来,即使在减少HDR模板剂量的情况下也可以提高 基因编辑效率,在不同细胞类型的多个基因组位点产生大约两到六倍的活性编辑细胞,如CD3+ T细胞、CD8+T细胞、 CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、y 5T细胞、B细胞、自然杀伤细胞以及原代和诱导的多能干细胞衍生的造血 干细胞。

  转染:将HDR模板与RNPs混合并孵育至少5分钟,然后与细胞混合,利用Lonza 4D核转染系统96孔模块, P3核转染试剂盒,进行转染。

  -T细胞,NK细胞,B细胞按照每个样本0.5-1 x伸个细胞进行电转,核转染条件EH-115;

  结论:PGA作为RNP纳米颗粒稳 定增强剂和tCTS修饰的HDR模板, 可以在多种原代免疫细胞中进行高 百分比编辑,并提高了编辑后的细 胞产量,从而为下一代过继细胞疗 法打开了大门。

  背景:自然杀伤(NK)细胞具有很强的抗肿瘤活性。但大多数输入的NK细胞仍在外周血中循环,而不是进入肿瘤部位, 因此在实体瘤的治疗中取得的成功非常有限。趋化因子及其受体在NK细胞分布中起重要作用。增强免疫细胞表面 趋化因子受体与肿瘤特异性趋化因子的匹配和驱动,可提高NK细胞的治疗效果。

  方法:CCR5-CCL5轴是NK细胞归巢到肿瘤部位的关键。因此,我们分析了癌症患者和健康献血者NK细胞上 CCR5的表达。然后我们用慢病毒和溶瘤病毒分别上调NK细胞和肿瘤细胞中CCR5和CCL5的表达。还进行了动 物实验,以检验溶瘤病毒与NK细胞联合的效果。

  结果:在各种实体瘤患者和健康人NK细胞中,CCR5在体外扩增前后均呈低水平表达。CCR5基因工程的NK 细胞具有增强肿瘤浸润和抗肿瘤作用,但在体内肿瘤模型中没有观察到完全消退。为了进一步提高治疗效果,我们 构建了表达CCL5的溶瘤痘苗病毒。体外实验结果表明,痘苗病毒能在肿瘤细胞中产生CCL5,而感染性不受影响。 CCL5修饰的痘苗病毒感染的肿瘤细胞上清液可促进CCR5过表达的NK细胞的定向运动,但不能促进对照组细胞 的定向运动。更重要的是,NK细胞对痘苗病毒具有抵抗力,接触后其功能不受影响。体内实验表明,与原型病毒相 比,表达CCL5的痘苗病毒可诱导更多的NK细胞聚集在肿瘤病灶内。

  结论:增强匹配的趋化因子和趋化因子受体是提高NK细胞归巢和治疗效果的一种有前途的方法。表达特异性趋 化因子的溶瘤痘苗病毒可以协同增强基于NK细胞的治疗效果。

  SS:前期研究证明,BCL11A红系增强子的核心序列是抑制成熟红系细胞中HBF所必需的,但在非红系细胞中是 必不可少的。CRISPR-Cas9介导的基因修饰在造血干细胞(HSCs)中表现出不同的效率、特异性和持久性。在这里, 我们证明了 Cas9: sgRNA核糖核蛋白介导的+58BCL11A红系增强子GATA1结合位点内的切割导致其的高度破坏, 降低了 BCL11A的表达,并诱导了胎儿y-珠蛋白。我们优化了在患者来源的造血干细胞中进行无选择的靶点编辑 的条件,将其作为一种几乎完全的反应,未检测到的遗传毒性或对干细胞功能的有害影响。与微同源介导的末端连 接修复相比,造血干细胞优先进行非同源修复。移植编辑的SCD造血干细胞的红系后代表达治疗水平的HbF并抵 抗镰刀病,而0-地中海贫血患者的红系后代表现出珠蛋白链的平衡得以恢复。

  核转结束后将细胞重悬于含有细胞因子的X-VIVO培养基中,并在24小时后换成EDM以进行体外分化。

  结论:文章优化了 sgRNA,在SpCas9蛋白增加额外的NLS,优化了核转染buffer,在健康供体和病人供体的 CD34+造血干细胞中得到了约95%的编辑效率,并且没有检测到基因毒性,可以为长期移植造血干细胞的编辑效率、 特异性和持久性方面提供解决方案。

  背景:自体树突状细胞(DC)疫苗可以诱导肿瘤特异性T细胞,但是其作用可以通过免疫抑制机制来抵消。铠 化合物已显示出体内免疫调节作用,可增强DC疫苗接种的效力。

  方法:这是一项前瞻性、随机、开放的2期研究,包括III期和IV期黑色素瘤患者接受gp100和酪氨酸酶 itiRNA负载的单核细胞来源的树突状细胞联合或不联合顺钳的3次双周疫苗接种。主要目标是研究免疫原性和可行 性,而次要目标是评估毒性和存活率。

  结果:对22例III期和32例IV期黑色素瘤患者进行分析。在接受钳化合物和不接受铠化合物的DC疫苗接种的 患者中,抗原特异性CD8+T细胞分别为44%和67%,功能性T细胞应答分别为28%和19%o 4例患者因毒性停 用钻化合物,继续DC单药治疗。DC单一疗法没有发生与治疗相关的3级或4级不良事件。在联合治疗期间,发生 了一个与治疗相关的3级不良事件,即由于液体超负荷而导致的失代偿性心力衰竭。临床结果参数没有明确显示有显著差异。

  结论:DC疫苗和祐化合物联合治疗黑色素瘤・ 患者是可行和安全的,但与DC疫苗单独治疗相比, 似乎并不能产生更多的肿瘤特异性T细胞应答或 改善临床结果。