华体会平台官网电话


华体会平台官网电话:干细胞治疗严重肢体缺血的研究进展

2022-06-16 10:45:29 |来源:hth华体会最新网站 作者:hth华体会网页版

  严重肢体缺血(Critical limb ischemia,CLI)是外周动脉疾病最严重的终末期表现,严重影响患者生活质量,甚至可导致截肢和死亡。血管重建是最有效的治疗方法,但并不适合所有患者。治疗性血管再生是指缺血部位生成新血管以改善血供。研究发现胚胎干细胞、iPSC、造血干细胞、内皮祖细胞和间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)等都具有促进血管再生的能力。干细胞在缺氧和组织损伤环境的刺激下主要通过释放各种因子(细胞因子、趋化因子、生长因子)的旁分泌效应诱导新生血管生成。基于安全性考虑,目前进入临床研究的主要是MSC和内皮祖细胞。

  我国是最早开展细胞治疗CLI的国家之一。在2003 年宣武医院谷涌泉教授就开展了自体骨髓干细胞移植治疗CLI的临床研究和应用。在过去近20年里,国内外学者在优化干细胞治疗CLI的方法上做了大量基础和临床研究。本文就近5年干细胞治疗CLI 基础和临床研究进行介绍。

  内皮细胞(Endothelial cell,EC)和血管平滑肌细胞(Smooth muscle cell,SMC) 是构成动脉血管的主要细胞。因此,理论上如果把干细胞诱导成EC后可能有更好的疗效。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSC)在体外可分化为EC。Yao等评估了BM-MSC衍生的EC治疗下肢缺血性疾病的效果。MSC在含50ng/ml血管内皮生长因子、10ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml 胰岛素样生长因子和5ng/ml 表皮生长因子的诱导培养基中培养7天后表达EC细胞标志。在后肢缺血小鼠模型中,分别在后腿内侧腓肠肌3个不同部位注射5 ×105未诱导的MSC、5 ×105诱导的MSC或磷酸缓冲液(Phosphatebuffered solution,PBS)。未诱导和诱导的MSC组小鼠的血液灌注量明显高于PBS组。但未诱导MSC组在第14天血液灌注量下降,提示疗效不稳定。虽然诱导MSC组的血液灌注量在第21天才上升,但保持持续上升状态,在第28天血液灌流量明显高于未诱导MSC组,小动脉和毛细血管密度也更高,α-SMA和CD31阳性细胞更多。由于从患者中分离和培养EC和SMC困难,Park等人尝试采用iPSC衍生的EC和SMC治疗CLI。他们先诱导iPSC向中胚层分化,然后分离CD34+祖细胞,将CD34+祖细胞分别诱导为EC和SMC。研究结果显示,在小鼠后肢缺血模型中,与单独注射EC或SMC 相比,EC与SMC联合注射改善血液灌注和提高保肢率的效果更好,毛细血管和小动脉密度更高。

  开发新的MSC也是研究热点。Chua等报道了人脐带表层来源的MSC在后肢缺血兔模型中刺激血管新生的作用。在缺血模型后肢肌肉的10个不同部位注射5×105个细胞,对照组仅注射生理盐水。结果显示,治疗组CD31阳性细胞数和肌肉毛细血管数明显多于对照组,血流灌注量高于对照组。

  比较不同干细胞疗效是不断提高疗效的途径之一。Nammian等比较了脂肪MSC(Adipose-derived MSC,AD-MSC)和BM-MSC的疗效。他们将小鼠随机分为PBS组、BM-MSC组和AD-MSC组。在后肢缺血模型腓肠肌的4个不同部位肌内注射5×105个BM-MSC或AD-MSC。在第14、21和28天的Tarlov评分及运动功能测评中,与AD-MSC组相比,BM-MSC组小鼠改善更加明显。Wang等则比较了BM-MSC和脐带MSC(Umbilical cord mesenchymal stem cell,UC-MSC)的促血管生成作用。血管生成相关因子在UC-MSC组的表达高于BM-MSC组;体外促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和成管的能力也是UC-MSC高于BM-MSC。小鼠后肢缺血模型中UC-MSC改善肢体血供的作用也比BMMSC强。

  注射途径是临床应用必须考虑的问题。Yan等在2型糖尿病大鼠足背缺血模型上比较了BM-MSC局部注射和静脉输注治疗下肢缺血的疗效。局部治疗组在创口周围的4个部位一共注射1×106个细胞,静脉注射组通过左股静脉注射5×106细胞。在第14天,伤口面积减小和微血管密度增加这两个疗效指标两组相当,但只有静脉注射组小鼠的高血糖状态得到改善。

  对干细胞进行基因改造是提高促血管生成疗效的重要途径。Maeda等将编码人Notch-1胞内结构域的cDNA质粒瞬时转染到人BM-MSC。在大鼠股动脉结扎后肢缺血模型中,缺血诱导7天后将1×105质粒转染细胞注射到缺血部位。结果与PBS组相比,细胞治疗组的血液灌注量和直径>15μm的小动脉数量显著增加。血小板反应素-4(Thrombospondin-4,TSP4) 也是重要的血管生长因子。Zhang等将表达TSP4的慢病毒转染的BM-MSC注射到CLI大鼠模型中,结果表明,在改善CLI大鼠的运动功能及促进新生血管方面TSP4-BM-MSC的效果优于BM-MSC。

  干细胞存活对疗效的影响显而易见,缺血部位缺氧不利于干细胞存活。Guan等采用释放氧的微球和MSC联合移植的方法促进细胞存活。在小鼠后肢缺血模型中进行MSC和微球联合注射4周后,MSC的存活、增殖、血管生成、血流恢复、骨骼肌再生程度和旁分泌效应明显优于单注射MSC,小鼠血管密度达到正常肢体的90%。

  干细胞治疗的高费用一直是大众关心的问题。降低细胞治疗费用的一个办法是提高细胞疗效。Thomas等设计了一个三维Ⅰ型胶原微凝胶作为MSC的载体,发现这种新型载体在后肢缺血动物模型中促进治疗性血管生成的效果比20倍数量的MSC还要好。在CLI模型微凝胶组只需要5×104MSC就可显著提高内皮标志物CD31(PECAM-1)表达,增加血管数量和促进肌肉组织中促血管生成因子的表达。

  MSC的促瘤性一直是研究人员担心的问题,尤其是治疗缺血性疾病的细胞是否会促进肿瘤的血管生成。Suzuki等采用小鼠后肢缺血伴随肿瘤种植模型探讨了这个问题。他们在C57BL/6J小鼠后肢缺血手术前1天背部注射B16F10黑色素瘤细胞。缺血手术第二天行后肢AD-MSC注射,对照组注射PBS。他们发现细胞注射可增强后肢组织毛细血管密度和血流,但不会增加远处黑色素瘤的生长及瘤体动脉密度和淋巴管的密度。

  所有细胞都分泌细胞外囊泡(Extracellular vesicle,EV)。作为细胞间信息传递的媒介,EV在体内稳态、血管生成、肿瘤进展和炎症等过程中起着作用。越来越多证据表明,MSC来源的EV也具有MSC功能。如人UC-MSC来源的EV富含血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子-Ⅰ、Wnt4血管生成素等蛋白。和MSC相比,EV不存在癌变的安全性问题,而且EV体积小,适合过滤法灭菌, 因此, 作为生物制剂有一定优势。在小鼠后肢缺血模型中,Lopatina等发现AD-MSC来源的EV对缺血肌肉损伤具有保护作用。但在进入临床应用之前MSC来源的EV也面临许多挑战,如生产工艺、质控、药代动力学等相关的研究目前还不多。

  早期研究主要以BM细胞为主。Mohamad报道了严重Buerger 病( 又称血栓闭塞性脉管炎,TAO)患者自体BM-MNC注射的长期结果。27例TAO患者47条下肢注射BM-MNC,平均随访(12.0±8.6)年。接受BM-MNC注射的患者在随访中没有进行大截肢手术。BM-MNC注射患者的无截肢生存率明显高于历史对照组。不过对于自体细胞的质量问题,Mohamed等报道了一项1b期临床研究的发现。他们一共完成了9例CLI患者的骨髓穿刺及MSC培养,但生产的细胞中超过30%检测到核型异常,导致细胞不合格。因此CLI患者自体细胞移植可能存在细胞质量问题,而大部分临床研究者可能没有考虑这个风险,因此没有做核型检测。

  在一项回顾性研究中,Yusoff等分析了自体BM-MNC注射治疗动脉粥样硬化性外周动脉疾病患者CLI中细胞数量与临床结局的关系,中位随访期为13.5年,按照注射细胞数1.2×109个为分界线,将患者分为大剂量组和小剂量组。分析发现,在无不良反应发生率和无截肢生存率方面,两组之间没有差异。

  以往的研究显示CD34+细胞和PB-MNC治疗血管炎引起的CLI(AICLI)均有效。Liu等最近报道了第一个评估CD34+细胞与PB-MNC治疗AICLI的随机、单盲非劣效性试验(NCT02089828)。50例AICLI患者随机分配到两组,所有患者皮下连续注射4天G-CSF,第5天进行外周血细胞单采。在全身麻醉下将细胞注射到缺血肢体。PB-MNC组CD34+细胞绝对数中位数为7.66×107,CD34+细胞组为3.17×107。仅47例患者完成了36个月随访,6个月时总无截肢生存率PB-MNC组是84.0%,CD34+细胞组是72.0%,这些比率在12个月、24个月和36个月保持一致,无显著差异,但CD34+细胞组的静息痛缓解率明显高于PB-MNC组。

  在另一项研究中,Lu等比较了自体BM-MSC和BM-MNC注射治疗糖尿病患者CLI和足部溃疡的长期临床疗效研究。纳入41例患者,随访3年,与BM-MNC治疗组相比,BM-MSC治疗后保肢时间和血流改善时间更长。

  Abdul等对不同来源、不同方案制备、不同剂量、不同途径给药的自体细胞治疗CLI的疗效和安全性进行了文献综述。他们一共检索到7个随机对照试验,包含359例患者。这些研究比较了BM-MNC与mPBSC、BM-MNC与BM-MSC、高细胞剂量与低细胞剂量、肌内(IM)和动脉内(IA)细胞注射途径的比较。总体上IM和IA途径之间截肢率没有明显差异,BM-MNC和mPBSC治疗截肢率无明显差异,高、低细胞剂量之间截肢率没有明显差异。

  目前,已有研究显示干细胞治疗值得作为治疗CLI的新药或新技术开发,研究虽然取得了令人鼓舞的结果,但同时也要看到,干细胞治疗仍存在许多问题和挑战,包括对治疗分子机制的探索,最理想细胞类型的确定,最佳剂量、途径和给药频率。不同来源的单核细胞和干细胞可能导致临床结果不同,因为来源不同的干细胞在生物学(可塑性、自我更新、分化、归巢、迁移、营养因子分泌)和免疫学(免疫应答调节)特性上有所不同。这可能与干细胞固有的生物学特性及细胞富集、培养过程中的变化有关。

  随着生活水平的提高,虽然人类寿命在延长,但CLI的发病率也在增加。根据国家干细胞临床研究备案制度,已有多种干细胞开展了糖尿病足的临床研究,也有进入临床1期的干细胞产品,但离进入市场还有多年时间。希望这些干细胞产品能够早点进入市场,造福广大CLI患者。

  现任福建医科大学协和医院中心实验室研究员。主要从事间充质干细胞临床应用和造血干细胞分化研究,为中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业委员会委员,《中华细胞与干细胞杂志》《中国临床药理学杂志》和Vascular Investigation and Therapy杂志编委。在Diabetes、JAMA、J Clin Oncol 、Cytotherapy等杂志发表多篇干细胞的临床应用研究论文。